熒光顯微鏡原理特點與使用

(一)熒光顯微鏡的基本原理和結構特征：熒光顯微鏡是運用一個高發光效率的線光源，通過正片疊底系統軟件傳出一定波長的光(如紫外線3650入或紫高清藍光4200入)做為激發光、激發標本里的熒光化學物質發送出很多不同顏色熒光后，然后通過物鏡和目鏡的變大觀察。那么在明顯對襯環境下，即便熒光很薄弱也容易分辨，敏感度高，主要運用于細胞膜的結構和功能以及成分等科學研究。熒光顯微鏡的基本結構是通過一般顯微鏡加上一些配件(如熒光燈源、激發濾片、兩色束分離設備和阻隔濾片等)的前提下所組成的。熒光燈源——般選用超高壓鈉燈(50一200W)，它可以傳出各種各樣波長的光，但每一種熒光化學物質都有一個造成熒光的激發光的波長，因此要加用激發濾片（一般有紫外線、藍紫色、藍色和綠色激發濾片），僅使一定波長的激發光通過照射標本上，而把別的光都吸取掉。每一種化學物質被激發陽光照射后，在極短時間發送出較直射光波長比較長的由此可見熒光。熒光具備專一性，一般都比激發光弱，為了能注意到專一的熒光，在物鏡后邊要加阻隔(或抑制)濾光片。它的功能有二：一是吸收阻攔激發光進到目鏡、以防于擾熒光和損害雙眼，二是挑選然后讓特殊的熒光通過，表現出了專一的熒光顏色。二種濾光片應該選擇搭配使用。

熒光顯微鏡從總體上激光光路來分為二種：

1．散射式熒光顯微鏡:激發燈源是由聚光鏡越過標本原材料來激發熒光的。常見暗視野集光器，還可用一般集光器，調整后視鏡使激發光轉射和旁射入標本上．這也是較為老式的熒光顯微鏡。其優點是低倍鏡時熒光強，而主要缺點隨放大倍率提高其熒光變弱．因此對觀查比較大的標本原材料不錯。

2．落射式熒光顯微鏡這也是近現代發展起來新型熒光顯微鏡，和上不一樣的地方是激發單從物鏡向降落射入標本表層，既用同一物鏡做為照明燈具聚光器和搜集熒光的物鏡。激光光路中應加上一個兩色束分離設備，它與光鈾呈45。角，激發光被反射面到物鏡中，并聚在試品上，試品所形成的熒光以及為物鏡鏡片表層、蓋玻片表層反射面的激發光同時進入物鏡，反返回兩色束分離設備，使激發光和熒光分離，殘留激發光被阻隔濾片消化吸收。如換采用不同的激發濾片／兩色束分離設備／阻隔濾片的搭配插塊，可滿足不同熒光反映產品的必須。此類熒光顯微鏡的優勢是視線照明燈具勻稱，顯像清楚，放大倍率越大熒光愈強。

（二）熒光顯微鏡操作方法．

1．開啟光源，超高壓鈉燈要加熱數分鐘才能達到高亮度。

2．散射式熒光顯微鏡需要在光源與聚光器中間安上所規定的激發濾片，在物鏡后邊安上對應的阻隔濾片。落射式熒光顯微鏡需要在激光光路的擴展槽中插進所規定的激發濾片／兩色束分離設備／阻隔濾片的插塊。

3．用低倍鏡觀查，依據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調節燈源核心，使之坐落于全部照明燈具光點的中心。

4．擺放標本片，變焦后就可以觀查。使用時需要注意：末裝濾光片不必保護眼睛立即觀查，以免造成眼的損害；用食油鏡觀查標本時，務必用無熒光的獨特油鏡；高壓鈉燈關閉后不可以馬上再次開啟，須經5min之后才能重新啟動，不然會平穩，危害汞燈使用壽命。

(三)觀查 在步態分析舞臺上的熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，由此可見經o．01％的丫啶橙熒光染料染色細胞，細胞質和細胞核被激發造成二種不同顏色熒光(深綠色和橘紅色)。