生物顯微鏡切片制作方法

生物顯微鏡切片制作方法：

取材-分割-固定-洗滌-脫水-透明-浸蠟和埋蠟-切片-粘片-脫蠟-染色-脫水-透明-封片

1 、固定液

( 1 )FAA ：福爾馬林一冰醋酸一酒精

50 ％或 70 ％乙醇 90ML+冰醋酸 5ml+福爾馬林（37 ％- 40％甲醛）5ml

固定時間最短需10h，一般不低于24h，可兼做保存液

幼嫩材料用 50 ％酒精代替70 ％酒精，可防止材料收縮。如材料堅硬，可略減冰醋酸，略增福爾馬林；如材料易收縮，可稍增冰醋酸。久置時可加5ml甘油，以防止蒸發和材料變硬。如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果更好：

50 ％乙醇 89mL +冰醋酸 6mL+福爾馬林（37％-40％甲醛）5mL

( 2 ）卡諾氏固定液：酒精一醋酞一氯仿

配方 1 ：純酒精 3 冰醋酸 1 (3:1)

配方 2 ：純酒精6＋冰醋酸1+氯仿3 （或純酒精30mL+氯仿5mL+冰醋酸10mL）一般材料不超過 24h ，固定根尖和花藥只需40-60min，固定后用95％酒精（85％酒精）沖洗，每級20min,如不能立即處理，需轉入70％酒精中保存。

2 、洗滌：FAA固定液無需洗滌直接脫水。

3 、脫水：材料中含水，水與石蠟不能混合，通常由50％、70％、80％、90％、無水乙醇，每次1h，其中無水乙醉需2次。材料大的需延長脫水時間（一般此后進行預染色）

4 、透明：常用透明劑為二甲苯和氯仿。先經乙醇和二甲苯混合液（1/2乙醇+1/2 二甲苯） , 后純二甲苯（2次），每次1-2h。

氯仿不宜在染色后透明。5 級進行；1/5 氯仿（4/5無水乙醇）→ 2/5→3/5 →4/5 ，純氯仿（ 2 次）每級3-4h；最后一次純氯仿中，放入純石蠟粉末數次，蓋好瓶蓋，36 ℃溫箱36h, 使材料慢慢浸蠟。

5 、浸蠟、包埋：石蠟必須純凈、不含雜質；浸蠟是使石蠟逐漸取代透明劑

石蠟：熔點 52一56 ℃ ，一般50一60℃

選用與乙醇和石蠟均能互溶的有機溶劑，如二甲苯，溫箱設置高于石蠟熔點2℃ 25％→50％→75 %（石蠟、二甲苯溶液）

材料透明好后，換入新的二甲苯，然后加入等體積的碎蠟，40℃溫箱，不斷加入碎蠟至飽和，然后升溫保持3一5h ，其間換純蠟3次，每次約1一2h 。（ 30min 也可）

包埋是將材料和石蠟一塊倒入小盒中，用加熱的鑷子迅速將材料按需要的切面和一定的間隔排列整齊，將小盒放入冷水中，凝固

6 、修塊：包埋好的材料，按需要的切面將蠟塊切成梯形，然后用蠟鏟把蠟塊底部牢固的粘在木質蠟座上

7 、切片：需先用切除的蠟塊試刀，確定刀的斜度為5°-8°為宜。一經調整合適后嗎，就不要隨便動，以免每次試刀。（8-15um )

8 、粘片：在干凈的載玻片上，滴一小滴蛋清甘油（或0.3％明膠水），然后加幾滴 3％福爾馬林或蒸餾水，用解剖針或鑷子輕輕將蠟片放在液面上，再將帶有蠟片的載玻片放在溫臺上，溫臺的溫度在45℃左右，蠟片受熱后慢慢伸直，用濾紙吸去多余液體，表面烤干，轉入30℃ 溫箱一晝夜

9 、脫蠟：二甲苯脫蠟。順序：二甲苯→二甲苯→1/2 +1/2純乙醇→100 ％乙醇→ 95%乙醇→85 ％乙醇→70 ％乙醇→50 ％乙醇→30％乙醇→蒸餾水→染色，以上每級需要5一10min

10 、染色： ( 1 ）鐵帆一蘇木精染色法（細胞學和胚胎學研究）

4％鐵帆媒染30min→自來水洗滌數次→蒸餾水洗滌數次→蘇木精染色1-2h→自來水洗滌數次→蒸餾水洗滌數次→2％鐵帆分色→并在顯微鏡下鏡檢→分色后立即用自來水沖洗30min→蒸餾水洗滌數次→30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→ 95％乙醇（盡量用吸水紙在切片邊緣將溶液吸凈、以免帶水）→100 ％乙醇（盡量將邊緣溶液吸凈、以免帶水）→1/2 甲苯→純二甲苯（ 2 次）→中性樹膠封片

注： ① 每道工序約3-5min② 蘇木精用無水乙醇配制成 10 ％的母液，經一個月的氧化后方可使用，用時稀釋到0.05 %

( 2 ）番紅一固綠染色法

70 ％乙醇→1％番紅6h或過夜（用 50％乙醇配制）→70 ％乙醇→85 ％乙醇→ 95％乙醇→0.5 %固綠5-30S(60S）或用滴染法（95％乙醇配制）→95％乙醇（10mm 、吸水紙吸盡邊緣溶液）→100％乙醇（ l0min 、吸水紙吸盡邊緣溶液）→1/2二甲苯+1 /2無水乙醇→純二甲苯（2 次）→中性樹膠封片

溶液配制： 1 ％番紅溶液：1g番紅，溶于99ml蒸餾水中

5％固綠溶液：取0.5g亮綠，溶解在100mL蒸餾水中

10 、脫水、透明脫水時間要短，因為乙醇有褪色作用

11 、封片

常用固封劑為加拿大樹膠

固封方法： ( 1 ）準備好清潔蓋片、鑷子、樹膠、白布等

( 2 ）用白布小心擦拭已經透明好的帶有標本的載玻片，并在其上滴一滴加拿大樹膠

( 3 ）用鑷子夫持一個清潔的蓋玻片，一端先與樹膠滴接觸，然后緩慢放下蓋片，使整個樹膠充滿蓋片

( 4 ）將封好的切片放至烤片夾中，放入溫箱（40 ℃ ）中烘干。